2025年5月14日，我院天然药物及仿生药物全国重点实验室马明课题组在Nature Chemistry上发表了题为“Structural insights into two thiamine diphosphate-dependent enzymes and their synthetic applications in carbon–carbon linkage reactions”的研究论文。该研究首次阐明了一类催化分子间碳-碳键连接反应的ThDP-依赖酶的晶体结构、底物选择性和立体选择性机制，并通过酶的理性改造和酶法全合成制备了大量碳-碳键连接化合物。
维生素B1（硫胺素，thiamine）经磷酸化后即变成其辅酶形式焦磷酸硫胺素（thiamine diphosphate, ThDP），而ThDP-依赖酶参与氨基酸代谢和糖代谢等重要的初级代谢。比如在缬氨酸的生物合成中，ThDP-依赖酶催化途径中的第一步反应：两个丙酮酸的碳-碳键连接（图1）。在该反应中，ThDP作为辅因子首先亲核进攻第一个丙酮酸分子（acyl donor）形成一个Breslow中间体，然后该Breslow中间体亲核进攻第二个丙酮酸分子（acyl acceptor），并随着ThDP的离去形成碳-碳键连接产物（图1）。
图1. ThDP-依赖酶在缬氨酸生物合成中的催化功能和催化机制
ThDP-依赖酶在上述初级代谢中催化了两个脂肪侧链α-酮酸的碳-碳键连接（可归为type I类反应，图2），值得关注的是近年来发现ThDP-依赖酶也参与了一些天然产物（次级代谢产物）的生物合成（图2），它们可以催化两个芳香侧链α-酮酸的碳-碳键连接（type II类反应）、脂肪侧链α-酮酸作为acyl donor和芳香侧链α-酮酸作为acyl acceptor的碳-碳键连接（type III类反应）、芳香侧链α-酮酸作为acyl donor和脂肪侧链α-酮酸作为acyl acceptor的碳-碳键连接（type IV类反应）（图2）。然而截至目前，催化type II-IV类型的ThDP-依赖酶尚没有叁维结构研究，其如何选择acyl donor和acyl acceptor的内在机制未知，这大大限制了它们在碳-碳键连接反应方面的催化应用。
图2. ThDP-依赖酶催化的四类α-酮酸碳-碳键连接反应
基于上述科学问题，课题组从自建的海洋特殊生境细菌菌种库中发现了一个天然产物（化合物1，图3），它是一个ThDP-依赖酶催化的type II型反应产物。通过对产化合物1菌株（金色微菌Chryseomicrobium sp. PKU-MA01392）的基因组测序和生物信息学分析，课题组发现了负责化合物1生物合成的ThDP-依赖酶CsmA。由于在CsmA的催化过程中中间体化合物4不稳定，因此通过NaBH4还原将化合物4还原为一对稳定的差向异构体4a和4b以便于分析和转化率计算（图3）。
图3. CsmA的来源菌株及其催化形成化合物1的过程
为了考察CsmA的底物杂泛性，课题组通过不同芳香侧链α-酮酸底物的两两组合开展体外催化反应，发现它展示出强大催化能力，可以在温和条件下催化一系列type II型α-酮酸碳-碳键连接反应，产生了35个α-酮酸连接产物及相应的70个NaBH4还原产物（图4）。CsmA催化的立体选择性由代表性产物的X-射线单晶结构得以确定。
图4. CsmA催化的代表性type II型α-酮酸碳-碳键连接产物
课题组继而以CsmA为模板在数据库中搜索能够催化其它反应类型的ThDP-依赖酶。通过进化树分析从一株短芽孢杆菌Brevibacillus migulae中发现了另一个BbmA，体外催化功能表征发现BbmA可以催化type III型α-酮酸碳-碳键连接反应。通过底物扩展和杂泛性考察，发现BbmA同样表现出强大催化能力，可以高效地催化脂肪侧链α-酮酸作为acyl donor和芳香侧链α-酮酸作为acyl acceptor，产生了51个α-酮酸连接产物及相应的102个NaBH4还原产物（图5）。BbmA催化的立体选择性由代表性产物的X-射线单晶结构得以确定。
图5. BbmA催化的代表性type III型α-酮酸碳-碳键连接产物
CsmA和BbmA的发现为研究它们的底物选择性机制提供了研究对象，因为它们接受同样的芳香侧链α-酮酸作为acyl acceptor，但是却接受不同类型的α-酮酸作为acyl donor。课题组成功解析了CsmA与ThDP、BbmA与ThDP的复合物晶体结构（图6）。晶体结构中ThDP的存在可以锚定acyl donor的结合口袋，因此通过比较CsmA-ThDP与BbmA-ThDP结构中acyl donor结合口袋周围的氨基酸残基，结合定点突变和体外催化表征，发现两个氨基酸残基即可决定acyl donor的选择性（CsmA中的S110和T278，对应BbmA中的L112和W288，图6）。通过对这两个残基的突变可以实现CsmA与BbmA催化类型的相互切换。
图6. CsmA-ThDP和BbmA-ThDP的晶体结构和acyl donor结合口袋比较
为了探究acyl acceptor的底物选择性机制，课题组进一步解析了BbmA与ThDP和HPPA的复合物晶体结构（图7）。由于HPPA是BbmA催化过程中的acyl acceptor，因此可以方便地锚定acyl acceptor的结合口袋。通过对acyl acceptor结合口袋周围氨基酸残基的定点突变和体外功能表征，发现一个残基（G484）即可决定其acyl acceptor的选择性（图7）。同时，该晶体结构还揭示了BbmA催化立体选择性的结构基础：由于R556与HPPA中羧基的盐桥作用使Breslow中间体只能从HPPA中α-羰基的Si面亲核进攻（图7），产生S构型的产物，这与前面酶催化产物的X-射线单晶结论完全一致。上述acyl acceptor的选择性机制和立体选择性机制，经研究发现同样适用于CsmA的催化。
图7. BbmA-ThDP-HPPA的晶体结构及其acyl acceptor结合口袋
至此，通过上述晶体结构和关键氨基酸突变研究，成功揭示了决定CsmA与BbmA的底物选择性机制和立体选择性机制。在此基础上的突变改造可以实现它们对acyl donor和acceptor的自由切换，产生全部type I-IV四种类型α-酮酸连接反应（图8）。其中通过单突变体CsmAG466F或者叁突变体BbmAL112S/W288T/G484F的底物扩展，成功制备了33个type IV型α-酮酸连接产物及相应的66个NaBH4还原产物。
图8. CsmA和BbmA的理性突变改造实现了type I-IV四种碳-碳键连接反应类型
最后，为了验证CsmA和BbmA在复杂化合物碳骨架构建中的催化潜力，课题组构建了呋喃内酯类抗生素的酶法全合成体系。将CsmA、BbmA或者它们的突变体与其他酶“一锅”混合，通过定向提供不同的简单小分子原料，可以实现呋喃内酯类抗生素γ-内酯母核上α、β、γ叁个位置取代基的理性替换和修饰，产生了36个呋喃内酯类抗生素类似物（包括31个新化合物，图9），其中包括了众多非天然氨基酸结构片段。
图9. 新颖呋喃内酯类化合物的酶法全合成
综上所述，本研究创新性和价值体现在：（1）系统性研究了在次级代谢途径中催化α-酮酸碳-碳键连接反应的ThDP-依赖酶，并首次阐明了它们的晶体结构、催化底物选择性和立体选择性机制。（2）虽然目前已有一些模拟ThDP-依赖酶的仿生催化研究，但在这些化学反应中如何实现特定acyl donor和acceptor的选择仍具有极大困难。而本研究发现并改造的两个ThDP-依赖酶可以实现α-酮酸的定向异源二聚。它们的底物扩展制备了120个α-酮酸连接产物及相应240个NaBH4还原产物，其中包括了354个新化合物，这些化合物可以作为结构单元用于更加复杂化合物的酶法合成或者化学合成。（3）利用两个ThDP-依赖酶实现了36个呋喃内酯类化合物的酶法全合成，体现了它们在复杂结构化合物碳骨架构建和结构多样化扩展中的巨大潜力。
本研究由课题组叁位博士后和一位博士生共同合作完成，黑料吃瓜网博士后刘谈、王贵阳、于佳慧，以及博士生李梦媛为共同第一作者，黑料吃瓜网马明教授为通讯作者。感谢黑料吃瓜网杨东辉研究员、叶敏教授、黎后华研究员，北京大学生命科学学院苏晓东教授以及北京大学基础医学院姜长涛教授的支持与帮助。感谢天然药物及仿生药物全国重点实验室仪器平台的尹富玲/贾红丽（X-射线晶体衍射测试）、李勤/刘芬（核磁共振测试）、李军/马雯（液相-质谱测试）等老师的大力支持！
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-025-01822-y
第一作者：
左起：刘谈（博士后）、王贵阳（博士后）、于佳慧（博士后）、李梦媛（博士生）
通讯作者介绍：
马明，北京大学博雅特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者，北京大学药学院、天然药物及仿生药物全国重点实验室研究员，博士生导师。研究领域为天然药用分子的发现和生物合成。近5年以通讯作者在Nat Chem、JACS、Angew Chem Int Ed、ACS Catal、Chem Sci、Acta Pharm Sin B等国际学术期刊发表SCI论文20余篇。任中国药学会海洋药物专业委员会委员、中国植物学会植物化学与资源专业委员会委员、中华中医药学会青年委员会委员、北京药学会天然药物专业委员会委员、国际期刊Chinese Journal of Natural Medicines编委会委员。
天然药物及仿生药物全国重点实验室
